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熒光-PCR法的主要理論依據說明

更新時間:2021-04-08點擊次數:1772
   熒光-PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程。PCR擴增時加入一對引物和一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,淬滅基團抑制報告基團的熒光發射。剛開始時,探針結合在DNA任意一條單鏈上,PCR擴增時,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,報告基團與淬滅基團發生分離,抑制作用被解除,從而熒光監測系統可接收到熒光信號。隨著PCR反應的進行,反應產物不斷累積,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環,收集一次熒光強度信號,這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,結合相應的軟件對產物進行分析進而得到一條熒光擴增曲線。熒光擴增曲線分熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期三個階段。指數期的PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系,因此我們選擇在這個階段進行定量分析,計算出待測樣品初始模版的量。
  熒光-PCR法的理論依據是什么?
  特定的待擴增基因片段起始含量越大,則指數擴增過程越短,當擴增速率趨于穩定后,則無論原來樣品中起始模板含量多少,終擴增片段的含量通常是一樣的。理想的擴增結果:Y=X×2n;其中:Y代表擴增產物量,X代表PCR反應體中的原始模板數,n為擴增次數;理論上PCR擴增效率為100,PCR產物隨著循環的進行成指數增長,但實際上DNA的每一次復制都不*,即每一次擴增中,模板不是呈2的倍增長;實際應為:Y=X(1+E)n,其中:E代表擴增效率,E=參與復制的模板/總模板,通常E≤1,E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X在1-105拷貝、循環次數n≤30時,E相對穩定,原始模板以相對固定的指數形式增加,適合定量分析,這也就是所謂的指數期;隨著循環次數n的增加(>30次),E值逐漸減少,Y呈非固定的指數形式增加,后進入平臺期。

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