一般熒光定量PCR試劑盒的標本預(yù)處理簡介

更新時間：2021-10-15

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　　熒光定量PCR試劑盒采用標本RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)-實時熒光擴增(PCR)兩步合并單管反應(yīng),操作簡便；采用熒光染料的實時定量PCR,靈敏度高于熒光探針PCR一個數(shù)量級,每個反應(yīng)達10個拷貝/次；自主產(chǎn)權(quán)不形成二聚體的引物設(shè)計使PCR反應(yīng)背景干凈,特別對于極低濃度病毒樣本定量準確,對弱陽性判讀可靠；選取人腸道病毒(EV)最保守的5’端非編碼區(qū)特異序列5’UTR(423-440)反意義鏈作為逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR下游引物,5’UTR(191-208)序列為PCR上游引物,擴增產(chǎn)生250bp片段,特異性達100%；聚合酶熱啟動、中間同序引物對等優(yōu)化措施使系統(tǒng)重復(fù)性好。

　　實時熒光PCR定量分析是通過實時檢測擴增產(chǎn)物量與起始靶基因量直接相關(guān)而定量。擴增產(chǎn)物熒光信號達到對數(shù)期的循環(huán)數(shù)Ct值與靶模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在負相關(guān)線性關(guān)系。即起始模板稀釋一倍達到對數(shù)期熒光強度所需的擴增循環(huán)就要增加一個循環(huán)數(shù)（Ct值）。

　　熒光定量PCR試劑盒的標本預(yù)處理說明：

　　選直腸試子或糞便浸出液(或血清、腦脊液、細胞培養(yǎng)物)0.1ml,糞便浸出液須自然沉淀10分鐘,取上清0.1ml(或0.1g固體標本)加裂解液1ml(0.5ml的4M異硫氰酸胍+0.5ml水飽和酚)變性裂解，強烈漩渦振蕩，再加100μl氯仿振蕩，最高速離心10分鐘，取上清加3×結(jié)合緩沖液(6M碘化納NaI)移至商業(yè)硅膠純化柱，用洗滌緩沖液(含70%EtOH的2M NaI液)洗柱兩次，加50μl DEPC處理的dH2O洗脫、離心收集純化的RNA?；蛄呀馍锨寮拥攘慨惐己?/10體積的2M醋酸鈉(PH4.0)置-20℃2小時再離心沉淀，75%冷乙醇洗滌一次，加50μl DEPC處理的dH2O溶解。