停乳鏈球菌（StD）核酸試劑盒說明書

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環境中進行設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。
磺間二甲氧嘧啶鈉(標準品)Phospho-cdc25C (Ser216) (63F9) Rabbit mAb2-氟-6-溴

毛地黃毒苷配基Phospho-cdc25C (Ser216) (63F9) Rabbit mAb2-氟-6-甲

柯諾辛PI4 Kinase Antibody(S)-1-BOC-2-哌甲酸甲酯

烏拉地爾(標準品)Nanog (D73G4) XP® Rabbit mAb溴-氟甲

夫西地酸鈉Nanog (D73G4) XP® Rabbit mAb2-甲基-5-溴甲酸甲酯

夫西地酸鈉(標準品)Stat3 (79D7) Rabbit mAb6-溴吲唑

3,5-二-L-酪氨酸Stat3 (79D7) Rabbit mAb對十二烷基磺酰疊氮

氟西林鈉(標準品)Ezh2 Antibody四溴雙酚 A

巴利森苷A；派立辛LAMP2 (D5C2P) Rabbit mAb1-羥基并三唑一水物

山楂酸,馬斯里酸Hamartin/TSC1 Antibody二-聯共晶

2-基并咪唑-5-磺酸,紫外線吸收劑 UV-TPhospho-Stat3 (Ser727) (D8C2Z) Rabbit mAb (Biotinylad)異基酸

毛萼素Mouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (APC Conjuga)雙酚 A

知母皂苷元53BP1 (P550) Antibody二二硅烷

4'-去甲鬼臼毒素Tri-Methyl-Histone H3 (Lys36) (D5A7) XP® Rabbit mAb過氧化氫異

杠柳毒苷Tri-Methyl-Histone H3 (Lys36) (D5A7) XP® Rabbit mAb多聚酸

1,2-二亞油酰甘油Phospho-Wee1 (Ser642) (D47G5) Rabbit mAb2-甲酰基-氧代酸酯

基-N-酰-β-D-氨基半糖苷Phospho-Wee1 (Ser642) (D47G5) Rabbit mAb2-蒎

2-溴咪唑并[1,2-a]吡Phospho-YAP (Ser127) Antibody甲基酸甲酯

激活素受體1ABcl-xL/FITC  熒光素標記抗Bcl-xL蛋白IgG100 ul

激活素受體2Ap-Bcl-xL(phospho-Ser62)/FITC  熒光素標記抗酸化(Ser62)Bcl-xL蛋白IgG20 ul

激活素受體2BPhospho-Bcl-2 (p-Thr56) /FITC  熒光素標記兔抗、大、Bcl-2IgG100 ul

2號染色體開放閱讀框88Phospho-Bcl-2 (p-Ser70) /FITC  熒光素標記兔抗、大、Bcl-2IgG100 ul

G蛋白偶聯受體ARHGEF18Bcl-6/Bcl-5/FITC  熒光素標記兔抗、大、原癌基因Bcl-6IgG100 ul

激活素受體1BBcl-10/CLAP/FITC  熒光素標記兔抗、大、Bcl-10IgG20 ul

雄激素受體相關蛋白24Bcl-10(phospho Ser218)/FITC  熒光素標記兔抗、大、Bcl-10IgG100 ul

淀粉樣肽前體蛋白（C端）Bcr/CD3D/FITC  熒光素標記兔抗、大、T淋巴細胞受體IgG100 ul

腺苷酸環化酶2Phospho-Bcr(p-Tyr177)/FITC  熒光素標記兔抗、大、T淋巴細胞受體IgG100 ul
停乳鏈球菌(StD)核酸試劑盒說明書葡糖淀粉酶抗體Trehalose中文名：海藻糖別名：分子式：C12H22O11

G蛋白γ11/Gγ11 抗體Chlorogenic acid中文名：綠原酸別名：分子式：C16H18O9

胃泌素抑制肽受體抗體Ethyl rutiside中文名：蕓香糖乙苷別名：分子式：C14H26O10

生長因子受體結合適應蛋白抗體18-Hydroxytritriacontan-16-one中文名：別名：分子式：C33H66O2

GARNL3蛋白抗體Mannitol中文名：甘露醇別名：D-Mannitol; D-甘露醇分子式：C6H14O6
檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內。
推薦循環條件:
1循環 50℃ for 2 min
預變性 1循環 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。